微生物組是自然界最基本、最寶貴的生物資源之一，其代謝功能直接影響著人體微環(huán)境與地球大環(huán)境的健康。因此，從微生物組中挖掘“特定代謝功能”的活體菌株資源，以保護(hù)和修復(fù)各種微生態(tài)系統(tǒng)，一直是業(yè)界孜孜以求的目標(biāo)。近日，青島能源所與青島星賽生物等合作發(fā)明了單細(xì)胞拉曼耦合培養(yǎng)技術(shù)（scRACS-Culture），建立了直接從環(huán)境樣品出發(fā)、針對(duì)“原位”代謝功能、單細(xì)胞精度、免培養(yǎng)、免熒光標(biāo)記的活體功能菌株挖掘儀器體系；進(jìn)而聯(lián)合青島張村河水務(wù)有限公司、中科院廈門城市環(huán)境研究所、自然資源部第一海洋研究所等，示范了城市污水處理系統(tǒng)中解磷菌的高效挖掘。這一“先篩后養(yǎng)”的scRACS-Culture體系，突破了目前“先養(yǎng)后篩”傳統(tǒng)范式的原理性局限，為微生物組功能探測(cè)與資源挖掘提供了原創(chuàng)的儀器裝備，相關(guān)成果發(fā)表于ISME Communications。
基于“先篩后養(yǎng)”的策略，單細(xì)胞拉曼耦合培養(yǎng)技術(shù)和儀器體系（scRACS-Culture）能夠全面高效地挖掘微生物組資源
長(zhǎng)期以來(lái)，從環(huán)境乃至人體生態(tài)系統(tǒng)中識(shí)別與獲取活體功能菌株資源，主要遵循“先養(yǎng)后篩”的思路，這導(dǎo)致了三個(gè)原理性缺陷。第一，功能篩選的“片面性”：由于該思路中純培養(yǎng)是功能篩選的前提條件，因此篩選的對(duì)象僅限于通常僅占菌群物種多樣性中很小比例的可培養(yǎng)微生物。第二，功能評(píng)價(jià)的“失真性”：該思路通常評(píng)價(jià)的是純培養(yǎng)后、實(shí)驗(yàn)室條件下的功能，而不是最為關(guān)鍵、真正重要的“原位”功能，而前者與后者經(jīng)常迥異。第三，菌株培養(yǎng)的“盲目性”：該思路目標(biāo)通常是從菌群中培養(yǎng)出所有細(xì)胞，而不是有靶向性地針對(duì)目標(biāo)功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，導(dǎo)致大量資源浪費(fèi)于非目標(biāo)功能細(xì)胞的培養(yǎng)上。
為了克服這三個(gè)原理性缺陷，單細(xì)胞中心荊曉艷高級(jí)工程師和公衍海助理研究員帶領(lǐng)的研究小組，基于單細(xì)胞中心提出的元拉曼組原理和青島星賽生物的單細(xì)胞拉曼光鑷分選儀器，發(fā)明了菌群中功能單細(xì)胞“先篩后養(yǎng)”的新策略。首先，從環(huán)境樣品中，不經(jīng)培養(yǎng)而直接根據(jù)單細(xì)胞拉曼光譜來(lái)識(shí)別具特定“原位”代謝功能的目標(biāo)微生物細(xì)胞；其次，基于能夠高度保持細(xì)胞活性的“液相單細(xì)胞拉曼分選耦合培養(yǎng)芯片”（RAGE-Culture芯片），根據(jù)拉曼光譜來(lái)高效地分選出這些目標(biāo)細(xì)胞，并對(duì)接與代謝表型組信息一一對(duì)應(yīng)、每孔一個(gè)細(xì)胞（One-Cell-One-Tube）的并行化單細(xì)胞培養(yǎng)，從而完成基于“原位”代謝功能的活體功能菌評(píng)價(jià)和獲取。此外，上述拉曼分選出來(lái)的功能單細(xì)胞也可以和“液相單細(xì)胞拉曼分選耦合核酸擴(kuò)增芯片”（RAGE-Seq芯片）對(duì)接，實(shí)現(xiàn)高覆蓋度（可高達(dá)100%）的單細(xì)胞基因組測(cè)序，支撐完整、精準(zhǔn)的全基因組代謝重建。
磷既是維持作物種植、養(yǎng)活全球人口的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素，也是造成水體污染的重要原因。水體及土壤中的磷源包括可溶磷和不可溶磷（包括無(wú)機(jī)不可溶磷源和有機(jī)不可溶磷源），其中只有可溶態(tài)磷能夠被生物利用。而解磷菌能夠把不可溶磷轉(zhuǎn)化為可溶解態(tài)磷源，因此，挖掘在水體、土壤等環(huán)境中“原位”行使解磷功能的微生物，具有重要的研究意義和產(chǎn)業(yè)價(jià)值。為了識(shí)別污水微生物組中的原位解磷菌，研究小組利用以Ca3(PO4)2為唯一無(wú)機(jī)磷源或以卵磷脂為唯一有機(jī)磷源的污水樣本（預(yù)先去除可溶性磷源），結(jié)合D2O孵育，從而通過(guò)單細(xì)胞拉曼光譜中C-D特征峰的強(qiáng)弱，在單細(xì)胞精度定量表征污水中微生物的解磷活性，進(jìn)而建立了原位解磷菌的單細(xì)胞識(shí)別-分選-培養(yǎng)流程。運(yùn)用這一scRACS-Culture體系，研究小組在青島張村河水務(wù)有限公司的污水處理池中，原位識(shí)別、分選和培養(yǎng)出了Comamonas spp.、Acinetobacter spp.、Enterobacter spp.和Citrobacter spp.等高效原位有機(jī)解磷菌。重要的是，其原位解磷活性均比實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)條件下高出一到兩倍，凸顯了“先篩后養(yǎng)”策略對(duì)菌株“原位”功能認(rèn)知與評(píng)價(jià)的重要意義。
同時(shí)，研究人員運(yùn)用scRACS-Seq，還發(fā)現(xiàn)了一類在污水中原位高效溶解不可溶有機(jī)磷源、在實(shí)驗(yàn)室條件下尚難以純培養(yǎng)的解磷菌新類群Cutibacterium spp.。精確到一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的高覆蓋度基因組重建表明，它們通過(guò)分泌金屬磷酸酯酶（MPP）、細(xì)胞壁錨定5’-核苷酸酶（ushA編碼）和質(zhì)膜定位的PstSCAB-PhoU轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，來(lái)高效溶解和清除污水中的胞外磷酸鹽。
由于scRACS-Culture的功能篩選不依賴于細(xì)胞純培養(yǎng)，因此能基于“原位”功能、針對(duì)菌群中所有的生物多樣性進(jìn)行挖掘，并精準(zhǔn)聚焦于目標(biāo)功能細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。這些特色克服了功能篩選片面性、功能評(píng)價(jià)失真性、菌株培養(yǎng)盲目性這三個(gè)傳統(tǒng)“先養(yǎng)后篩”策略的潛在缺陷。
除了免培養(yǎng)、無(wú)需熒光標(biāo)記、活體表征等特色，單細(xì)胞拉曼光譜還具有信息豐富的優(yōu)勢(shì)，能“全景式”地刻畫底物代謝、產(chǎn)物合成、環(huán)境應(yīng)激等代謝表型組，還可區(qū)分微生物細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的種類，因此scRACS-Culture對(duì)于人體、動(dòng)植物和微生物細(xì)胞資源產(chǎn)業(yè)具有共性方法學(xué)意義。下一步，研究人員將基于流式拉曼分選儀FlowRACS，開發(fā)高通量的scRACS-Culture/Seq技術(shù)體系，服務(wù)于規(guī)?；纳滴镔|(zhì)功能探測(cè)和資源挖掘。
該工作由青島能源所單細(xì)胞中心徐健研究員和馬波研究員主持，與青島張村河水務(wù)有限公司荊玉姝高級(jí)工程師、牟潤(rùn)芝部長(zhǎng)、中科院廈門城市環(huán)境研究所崔麗研究員、自然資源部第一海洋研究所曲凌云研究員等合作完成。該工作得到了國(guó)家重大科學(xué)儀器研制項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等的支持。
Xiaoyan Jing#, Yanhai Gong#, Huihui Pan, Yu Meng, Yishang Ren, Zhidian Diao, Runzhi Mu, Teng Xu, Jia Zhang, Yuetong Ji, Yuandong Li, Chen Wang, Lingyun Qu, Li Cui, Bo Ma*, Jian Xu*. Single-cell Raman-activated sorting and cultivation (scRACS-Culture) for assessing and mining in situ phosphate-solubilizing microbes from nature. ISME Communications, 2022.
