纖維小體是細(xì)菌分泌的高效降解木質(zhì)纖維素的多酶復(fù)合體，其高效降解機(jī)制及產(chǎn)纖維小體細(xì)菌的遺傳改造是木質(zhì)纖維素降解利用研究中的重要方向之一。熱纖梭菌的Cel48S是其纖維小體的主要外切葡聚糖酶，是其纖維小體中含量最高的組分，在纖維素降解過程中起著關(guān)鍵作用。但是，Cel48S的內(nèi)在性質(zhì)使得對(duì)Cel48S的純化存在很大的困難，文獻(xiàn)中對(duì)該酶的性質(zhì)鑒定報(bào)道存在很多相互矛盾之處，與該酶在纖維小體中的重要作用并不相符，這使人們難以深入揭示纖維小體的高效降解機(jī)制。青島能源所代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)崔球研究員、馮銀剛研究員、劉亞君副研究員等基于前期開發(fā)的熱纖梭菌遺傳改造工具，通過對(duì)纖維小體的定向改造，實(shí)現(xiàn)了對(duì)其原位Cel48S催化結(jié)構(gòu)域的高效純化，從而成功的對(duì)Cel48S的酶學(xué)與結(jié)構(gòu)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)解析，揭示了Cel48S在纖維小體中的真正作用。相關(guān)成果已于2018年1月13日在線發(fā)表于Biotechnology for Biofuels （Liu YJ, et al, 2018, 11:6）。
木質(zhì)纖維素水解糖化是實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的高值利用的第一步，是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。為了打破國(guó)外酶制劑技術(shù)壟斷、突破糖化技術(shù)瓶頸，代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于開發(fā)基于熱纖梭菌纖維小體的新型整合生物糖化技術(shù)路線。在這一路線框架下，需要通過對(duì)纖維小體這一多酶復(fù)合體的機(jī)制解析以及定向改良從而獲得高效的全菌催化劑。為此，代謝物組學(xué)團(tuán)隊(duì)針對(duì)梭菌系統(tǒng)地開發(fā)了非模式微生物基因操作工具(J Microbiol Methods, 2012, 89: 201-8.; PloS One, 2013, 8:e69032; Appl Microbiol Biotechnol, 2014, 98: 313-23.)，在熱纖梭菌中實(shí)現(xiàn)了快速、準(zhǔn)確的基因敲除、過表達(dá)和精準(zhǔn)編輯，完成了對(duì)熱線梭菌纖維小體腳架蛋白的功能貢獻(xiàn)、解除纖維小體反饋抑制的定向改造（Biotechnol Biofuels, 2015, 8: 36; Biotechnol Biofuels 2017, 10: 124）等系列工作。同時(shí)，團(tuán)隊(duì)建立了成熟的X射線晶體學(xué)和生物大分子核磁共振等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺(tái)，完成了多個(gè)纖維小體組分和工業(yè)酶催化機(jī)制的研究（J Struct Biol, 2014, 188: 188-193; Appl Microbiol Biotechnol, 2015, 100: 2203–2212）。在完善的遺傳操作平臺(tái)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析平臺(tái)的基礎(chǔ)之上，研究人員對(duì)纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S進(jìn)行了更系統(tǒng)深入的研究。
作為熱纖梭菌纖維小體中含量最高的的關(guān)鍵酶組分，Cel48S的酶學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一直受到廣泛的關(guān)注。團(tuán)隊(duì)前期通過核磁共振方法修正了文獻(xiàn)中關(guān)于Cel48S的組裝模塊的結(jié)構(gòu)，對(duì)纖維小體的組裝方式有了新的認(rèn)識(shí)（J Struct Biol, 2014, 188: 188-193）。對(duì)于Cel48S的催化模塊，由于難于異源表達(dá)，與纖維小體結(jié)合緊密難以從原位分離，文獻(xiàn)中對(duì)其性質(zhì)的報(bào)道相互矛盾，該酶在纖維小體中的真正作用并未得到有效闡明。為了解決這一問題，研究人員使用前期建立的熱纖梭菌精準(zhǔn)遺傳操作工具，通過在Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域后面插入編碼組氨酸標(biāo)簽和終止密碼子的序列，實(shí)現(xiàn)了將Cel48S的催化結(jié)構(gòu)域從纖維小體中分離并從培養(yǎng)物上清中的一步直接純化。在此基礎(chǔ)上，通過酶學(xué)測(cè)定和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，確定了天然Cel48S的高活性、結(jié)晶纖維素的底物偏好以及底物偶聯(lián)的誘導(dǎo)契合效應(yīng)，真正徹底闡明了纖維小體關(guān)鍵組分Cel48S的結(jié)構(gòu)功能特性。同時(shí)，本研究提供了一個(gè)基于精準(zhǔn)遺傳操作實(shí)現(xiàn)分離純化原位的纖維小體或其他分泌蛋白的方法，為進(jìn)一步研究纖維小體木質(zhì)纖維素降解機(jī)制及構(gòu)建木質(zhì)纖維素糖化的定向改良菌株提供了范例和基礎(chǔ)。
相關(guān)系列研究得到了國(guó)家科技支撐計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)以及山東省糖產(chǎn)業(yè)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)盟建設(shè)任務(wù)的資助。（文/圖 劉亞君 馮銀剛）
圖1. 熱纖梭菌Cel48S定向改造示意圖（a）、Cel48S底物偏好性（b）及結(jié)構(gòu)分析（c）
原文鏈接：
https://biotechnologyforbiofuels.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13068-017-1009-4
Liu, Y.-J., S. Liu, S. Dong, R. Li, Y. Feng and Q. Cui (2018). "Determination of the native features of the exoglucanase Cel48S from Clostridium thermocellum." Biotechnology for Biofuels 11(1).
