單個細胞是生命活動的基本單元，也是生物進化的基本單位。因此單細胞技術(shù)正在推動生命起源、細胞功能異質(zhì)性機制、生命暗物質(zhì)挖掘與利用等領(lǐng)域的一系列重大突破。單細胞拉曼光譜（SCRS）能非標記、非侵入性、無損、全景式地揭示細胞代謝狀態(tài)，因此基于拉曼光譜的單細胞分選（Raman-Activated Cell Sorting，RACS），在單細胞技術(shù)體系中有著廣闊的應(yīng)用前景（Biotechnol Adv，2019）。但是，拉曼譜圖采集時間長、分選通量低等問題，限制了RACS的廣泛應(yīng)用。針對這些關(guān)鍵瓶頸，青島能源所單細胞中心發(fā)明了基于介電單細胞捕獲/釋放的拉曼激活液滴分選技術(shù)pDEP-RADS，并研制成功國內(nèi)外首臺高通量流式拉曼分選儀產(chǎn)品樣機FlowRACS。利用FlowRACS，首次示范了基于分子光譜、非標記式、單細胞精度、高通量流式的酶活篩選，為酶資源的探測和挖掘開辟了一個全新的技術(shù)路線。該工作近日發(fā)表于《科學(xué)進展》（Science Advances）。
開發(fā)首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS，服務(wù)高通量酶篩選
一個微生物細胞的體積通常只有一個人體細胞的千分之一。在高速液流中，針對這么微小的細胞，如何精確捕獲、采集高質(zhì)量全譜拉曼并實現(xiàn)高通量分選，一直是業(yè)界的重點和難點。針對上述問題，青島能源所單細胞中心王喜先、辛一、任立輝等帶領(lǐng)的研究小組發(fā)明了“介電單細胞捕獲/釋放拉曼激活液滴分選技術(shù)”pDEP-RADS（Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting；圖1）。通過周期性施加介電場，確保高速流動的單細胞被精確捕獲在拉曼激光位點，以允許高質(zhì)量拉曼譜圖的采集；進而單細胞經(jīng)液滴包裹，借助介電實現(xiàn)目標單細胞微液滴的高通量分選。
在此關(guān)鍵技術(shù)突破的基礎(chǔ)上，研究人員研制成功首臺高通量流式拉曼分選儀FlowRACS。研究人員采用低拉曼背景石英玻璃為微流控芯片基材，以提高表型檢測的普適性；以氧化銦錫（而非金屬）加工電極陣列，以避免光熱損傷；采用先拉曼檢測后液滴包裹、液滴產(chǎn)生和分選同步進行的策略，避免了液滴對拉曼信號采集的影響，從而提高檢測準確率并簡化系統(tǒng)操作；最后通過自主開發(fā)的QSpec軟件，實現(xiàn)了平臺的自動化運行。
新陳代謝是一切生命活動的基礎(chǔ)，而新陳代謝離不開酶的催化作用。因此，酶是最主要的生物資源之一，也是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要載體。例如，甘油三酯（TAG）是人體、動物和植物中油脂的主要成分，它具有極高的能量存儲密度，而且在幾乎所有細胞中都存在，因此是自然界的“能量存儲貨幣”。細胞中TAG生物合成的最后一步和限速步驟，是二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGATs）。自然界中DGATs的功能極其多樣，其活性不僅調(diào)控TAG產(chǎn)物的合成效率，還控制著其飽和度、碳鏈長度等；這些理化性質(zhì)決定了TAG的用途和經(jīng)濟價值，例如是適合做營養(yǎng)品還是生物燃油。因此，作為油脂分子設(shè)計的關(guān)鍵工具，DGATs 的挖掘和篩選具有重大的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。
但是，傳統(tǒng)的DGATs篩選方法通常包括候選酶基因在底盤細胞中的表達、細胞擴增培養(yǎng)以積累足夠生物質(zhì)、從生物質(zhì)中提取并通過薄層層析法分離TAG產(chǎn)物、用氣相和液相質(zhì)譜來分析和定量TAG中組分等繁雜步驟。這一流程通常需要一周時間，既耗時耗力，而且難以分析生長緩慢或尚難培養(yǎng)的細胞。業(yè)界也嘗試用尼羅紅等熒光染料來標記細胞中油脂，然后通過流式細胞熒光分選儀（FACS）分選細胞，但是熒光染料特異性低、難以定量分析、細胞壁對染料的通透性低或不可控、油脂飽和度無法表征等瓶頸問題仍然沒有解決。
針對這些瓶頸問題，單細胞中心“另辟蹊徑”，提出了利用以拉曼為代表的分子光譜來篩選酶促反應(yīng)活性的新思路。利用FlowRACS，單細胞中心首次在單個微生物細胞精度，實現(xiàn)了DGATs（在人體、動物和植物中催化油脂的合成）體內(nèi)活性的非標記式、高通量、高準確率、無損分選。針對來源于微擬球藻的候選DGAT基因庫，僅通過為時僅10分鐘的FlowRACS運行，就成功獲得3個已報道的強效基因和2個從未報道過的弱效基因。而前期基于傳統(tǒng)方法對這3個強功能基因的篩選和表征，歷時長達數(shù)月時間。
與基于生物質(zhì)提取和質(zhì)譜分析的胞內(nèi)油脂分析方法相比，F(xiàn)lowRACS的篩選時間、試劑耗材和人工成本僅為其百分之一，大大提高了酶的篩選效率。與FACS相比，F(xiàn)lowRACS不再需要針對酶的底物或產(chǎn)物進行熒光標記，可同時定量表征油脂含量和飽和度等多種關(guān)鍵的酶活指標，而且具有更高的檢測靈敏度和更寬的動態(tài)范圍。此外，能夠熒光標記的底盤細胞很有限，而FlowRACS適用于任何細胞，這一特色對于從菌群等尚難培養(yǎng)微生物中直接挖掘酶和細胞工廠等生物資源來說，具有特別重要的意義。
突破國產(chǎn)科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)化瓶頸，推動原創(chuàng)高端生命科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)發(fā)展
近年來，在科研人員的努力與國家政策的支持下，我國高端科學(xué)儀器研制取得了積極的進展，但是僅僅是“追趕”和“并行”的發(fā)展方式并不能夠從根本上扭轉(zhuǎn)高端儀器依賴進口的現(xiàn)狀。放眼中國各大科研院所、高校和企業(yè)研發(fā)中心的實驗室，進口儀器、尤其是高端進口儀器仍然占據(jù)著數(shù)量與經(jīng)費的絕對優(yōu)勢。一旦遭遇國外的技術(shù)封鎖，我國的科學(xué)研究將遭遇無源之水、無米之炊的窘境，科技發(fā)展將面臨前所未有的困局。
然而，科學(xué)儀器產(chǎn)業(yè)卻是我國科技鏈條的最短板之一。全球科學(xué)儀器公司20強中，國產(chǎn)儀器公司無一上榜。2019年美國儀器行業(yè)巨頭賽默飛、丹納赫、安捷倫的全年收入分別達到255.4億美元、179.1億美元和51.6億美元，而排名最靠前的國產(chǎn)儀器廠商同期營業(yè)收入僅僅為7.34億美元。與此同時，2020年全球單細胞分析市場規(guī)模估計為26.8億美元，預(yù)計在2019至2026年以16.9%的年復(fù)合增長率增長，國內(nèi)市場規(guī)模預(yù)計35億人民幣。強大的市場需求以及市場占有率狹小的局面，對國產(chǎn)單細胞分析儀器的研制和產(chǎn)業(yè)化提出了巨大的挑戰(zhàn)，同時也帶來了前所未有的機遇。
基于pDEP-RADS技術(shù)，單細胞中心推出了國內(nèi)外首臺全譜分選通量達到600個細胞/分鐘的高通量流式拉曼分選儀產(chǎn)品樣機FlowRACS。FlowRACS具有完全自主的知識產(chǎn)權(quán)，已于今年6月份完成了現(xiàn)場技術(shù)驗收。單細胞中心長期致力于微生物單細胞技術(shù)和裝備的研制和產(chǎn)業(yè)化，前期已經(jīng)陸續(xù)研制成功并產(chǎn)業(yè)化臨床單細胞拉曼藥敏快檢儀（CAST-R）、單細胞拉曼分選-測序耦合系統(tǒng)（RACS-Seq）、積木式單細胞微液滴快速顯微分選系統(tǒng)（EasySort）等單細胞分析儀器系列產(chǎn)品。做為該儀器系列的最新成員，F(xiàn)lowRACS的研制成功和應(yīng)用拓展，將為單細胞科學(xué)與產(chǎn)業(yè)提供一個全新的研究工具，并推動我國細胞科學(xué)高端儀器產(chǎn)業(yè)的自主創(chuàng)新。
上述工作由單細胞中心馬波研究員和徐健研究員主持完成，并得到了國家合成生物學(xué)重點研發(fā)計劃、國家重大科學(xué)儀器研制項目、山東能源研究院、青島星賽生物科技有限公司等的支持。
圖1單細胞中心研制的pDEP-RADS技術(shù)及儀器系統(tǒng)
附錄：
Xixian Wang#, Yi Xin#, Lihui Ren#, Zheng Sun, Pengfei Zhu, Yuetong Ji, Chunyu Li, Jian Xu*, and Bo Ma*, Positive dielectrophoresis based Raman-activated droplet sorting for culture-free and label-free screening of enzyme function in vivo, Sci. Adv, 2020, DOI: 10.1126/sciadv.abb3521
Yuehui He#, Xixian Wang#, Bo Ma*, Jian Xu*, Ramanome Technology Platform for Label-free Screening and Sorting of Microbial Cell Factories at Single-cell Resolution. Biotechnol. Adv, 2019, DOI: 10.1016/j.biotechadv.2019.04.010.
